В системе CRISPR палиндромные повторы разделяют короткие фрагменты ДНК, которые соответствуют вирусам, инфицировавшим бактерию в прошлом. Вместе с другими молекулами, закодированными геномом бактерии (CRISPR-ассоциированные белки, они же Cas), эти фрагменты составляют адаптируемую иммунную систему бактерии. Представьте себе армию, поднятую по боевой тревоге, причем у каждого солдата в руках флаг, обозначающий его цель. Cas-белки – это солдаты, а флаги – последовательности между повторами, то есть последовательности, соответствующие заразным вирусам. Если в бактерию вторгнется новый вирус с последовательностью, очень похожей на любой флаг, последовательность (флаг) свяжется с этим вирусом, а Cas-белок порежет его на куски и обезвредит.

Даудна и Шарпантье работали с Cas-белком под названием Cas9, который в ходе эволюции начал вырабатываться у стрептококков, и придумали, как сделать флаг, который направит Cas-белок к желаемой геномной цели, из любой последовательности. Если, скажем, я хочу разрезать ген ПГ в геноме помидора, я создаю последовательность-проводник (флаг), опираясь на свои знания о составе последовательности гена ПГ. Когда я введу свою последовательность-проводник и Cas-белок в клетку, Cas9 доставит ее к гену ПГ. Там моя последовательность свяжется с такой же последовательностью гена ПГ, а Cas9 разрежет ДНК – точно так же, как Fok1 режет ДНК при применении ЦПН и TALE-нуклеаз. Однако, в отличие от ЦПН и TALE-нуклеаз, последовательности-проводники CRISPR дешевы и их просто проектировать, поскольку они состоят не из искусственных белковых комплексов, а из букв ДНК. Кроме того, они меньше и доставлять их в клетку несколько проще. А еще они гибче. В дальнейшем были открыты и другие Cas-белки с самыми разными способностями – например, они режут только одну цепь ДНК или связываются с ДНК, но ничего не разрезают, а просто остаются на месте и подавляют экспрессию гена. Теперь, когда у нас есть инструменты редактирования генома на базе CRISPR, генным инженером может стать каждый.

Технологии программируемого разрезания ДНК преобразили ландшафт генной инженерии. Сегодня мы можем не просто вставлять ДНК в заданное место генома, но и изымать отдельные буквы ДНК, а также находить, взламывать и отключать конкретные гены. Точное редактирование генома снижает количество непредсказуемых последствий генной инженерии, поскольку сводит к минимуму вероятность, что разрез будет сделан не в одном месте генома, а в нескольких. Однако, что примечательно, единственное, что делают эти программируемые нуклеазы – это ищут и иногда разрезают последовательности ДНК. Когда ДНК уже разрезана, генные инженеры применяют различные приемы, чтобы проверить, действительно ли желаемое редактирование состоялось. А тут не всегда все идет по плану.

Случайная трансгенность

Когда биотехнологическая компания Recombinetics решила создать безрогих голштинцев, она намеревалась изменить геном только в одном месте – заменить одну версию гена другой. Задача создать что-то новое не ставилась. Комолый аллель, создающий безрогий фенотип, возник у коров в ходе эволюции много сотен, а то и тысяч лет назад. В компании понимали, что комолый аллель можно внедрить голштинцам при помощи традиционной селекции, но это приведет к потере качества голштинской породы как молочной, и на восстановление потребуется несколько поколений. Идеальным решением была точная генная инженерия при помощи программируемой нуклеазы. А поскольку и сам аллель, и его фенотип были прекрасно описаны и уже занимали место в пищевой цепочке, можно было рассчитывать, что Управление по контролю за продуктами питания и лекарствами почти наверняка согласится присвоить генно-отредактированным голштинцам статус «признанный безвредным».

С последним пунктом могли возникнуть сложности. В 2015 году, когда эксперимент уже шел полным ходом, и Управление по контролю за продуктами питания и лекарствами, и Министерство сельского хозяйства только еще решали, как быть с новой категорией генно-инженерных организмов – с организмами, в чей геном в результате редактирования были внесены изменения, которые могли произойти и в результате традиционной селекции. В эту категорию по определению входили только цисгенные организмы, поскольку любое перемещение ДНК между видами (что создает трансгенные организмы) вне лабораторных условий невозможно. Было ясно, что если эксперимент Recombinetics пройдет по плану, то безрогие голштинцы идеально впишутся в эту категорию. А вот принятие их сельскохозяйственной промышленностью напрямую зависит от решения органов государственного регулирования.

Ученые из Recombinetics разработали TALE-нуклеазу, которая должна была связываться с участком первой хромосомы, содержавшим подлежащий замене аллель. При помощи бактериальной плазмиды в качестве вектора исследователи доставили в линии клеток коров ДНК, закодированную для TALE-нуклеазы и абердин-ангусской версии комолого аллеля. Дальше, как они надеялись, в каждой линии клеток должно было произойти следующее: (1) клеточные механизмы создадут кучу копий TALE-нуклеазы и комолого аллеля, (2) TALE-нуклеазы отыщут обе копии первой хромосомы в клетке и свяжутся с соответствующими последовательностями, (3) Fok1 из TALE-нуклеаз разрежет ДНК в обеих копиях первой хромосомы и создаст в каждой по разрыву. Повреждение ДНК приведет в действие клеточные механизмы реагирования, которых у клетки два: негомологичное соединение концов, когда цепь ДНК просто сращивается обратно и при этом нередко теряются два-три основания, и гомологичная рекомбинация, когда в качестве лекала для восстановления ДНК используется вторая копия хромосомы. Ученым нужно было добиться, чтобы клетка предпочла гомологичную рекомбинацию, взяв при этом за образец для сращивания ДНК не вторую копию первой хромосомы (которую, как рассчитывали исследователи, TALE-нуклеаза тоже разрежет), а абердин-ангусскую версию аллеля, введенную в клетку вместе с TALE-нуклеазой. В случае удачного исхода обе копии первой хромосомы были бы восстановлены этим методом точной генной инженерии – и больше бы ничего не произошло.

Когда эксперимент завершился, ученые обследовали 226 клеточных линий – все, которые они пытались модифицировать, – чтобы оценить результаты. В пяти оказалось по одному комолому аллелю, а в трех он имелся в обеих копиях первой хромосомы. Затем ученые клонировали те клеточные линии, которые удалось модифицировать, и создали эмбрионы – с расчетом впоследствии получить из них безрогих бычков. Долгие месяцы спустя на свет появились два здоровых бычка – Бури и Спотиджи.

Тогда ученые проверили свою работу. Произошли ли в ходе эксперимента изменения в последовательности комолого аллеля? Не случилось ли такого, что TALE-нуклеаза связалась не только с намеченным местом в первой хромосоме, но и с другими местами генома, внедрив комолый аллель и туда тоже? Ученые полностью секвенировали геномы клеточных линий, из которых создали Бури и Спотиджи, и обнаружили, что комолый аллель и в самом деле заменил некомолый в обеих хромосомах в обеих клеточных линиях. Исследователи пристально изучили все участки генома, напоминавшие те, на поиск которых была запрограммирована TALE-нуклеаза (всего 61 751 участок), и не нашли никаких признаков дополнительного включения комолого аллеля или его фрагментов. И ни