— криосохранение,

— замедление роста,

— сушка (распылительная и лиофильная) — для клеток микроорганизмов.

Криосохранение

Криосохранение — замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196 °C.

Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов:

— вид и тип клеток,

— их концентрация в суспензии,

— состав среды для консервирования,

— вид и концентрация криопротектора,

— режим охлаждения и отогрева,

— способ реабилитации клеток после отогрева.

Существенную роль в успешном замораживании клеток играет их морфофизиологическое состояние: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Клетки для замораживания отбирают в середине экспоненциальной фазы ростовой кривой.

Немаловажное значение имеет и плотность замораживаемой суспензии. Оптимальные результаты по восстановлению клеток были получены при замораживании клеточной суспензии плотностью 1∙105-5∙106 клеток в 1 мл.

Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества, например:

— 2–6 % маннит или сорбит для уменьшения размера вакуолей;

— аминокислоты, в первую очередь пролин, который служит для связывания воды в клетке (концентрация до 1 моля или 11,5 %), аспарагин, γ-аминомасляную кислоту слоту;

— диметилсульфоксид (ДМСО), который добавляют к среде для предкультивирования в концентрации от 2,5 до 10 % на 48 часов для увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны;

— кроме того, применяют искусственное закаливание к холоду, когда снижают температуру культивирования, имитируя естественный осенний процесс подготовки к периоду зимнего покоя (применим только для растений умеренного климата). Клеточные культуры выдерживают несколько суток при температуре +8 — +10 °C, а затем при +2 — +5 °C в течение 1–6 недель.

Процесс замораживания растительных клеток от животных отличает, в основном, наличие этапа предварительного культивирования.

Криопротекторы — вещества, позволяющие снизить повреждающее действие физико-химических факторов при криоконсервировании. К ним относятся сахароза, декстран, этиленгликоль, поливинилпирролидон, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин. Для определения токсичности криопротектора клетки выдерживают при комнатной температуре в различных его концентрациях в течение 30–50 минут, после чего определяют их жизнеспособность. Дополнительно оценивают его протективные свойства путем пробного замораживания и оттаивания культур. Наиболее часто в качестве криопротекторов используют глицерин и ДМСО. Перед добавлением криопротектора суспензию клеток концентрируют путем центрифугирования, надосадочную жидкость сливают. Криопротекторы вносят в культуру за час до замораживания, что приводит к изменению проницаемости мембраны, изменению точки замерзания и оттаивания.

Программы охлаждения могут быть различными, но для всех них характерна медленная скорость охлаждения. При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от изучаемого образца и обработки криопротекторами, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. В этом случае клетки повреждаются. Обычно охлаждение проводят в два этапа (рис. 27):

Рис. 27. Замораживание клеток:

а) быстрое, б) медленное, поэтапное

1. От +20 до -28 °C со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до -35 °C), выдерживают при этой температуре 15 минут.

2. Погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до — 196 °C)

Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии — на спиртовой бане (0,5–1 литр спирта наливают в термос с металлической колбой, погружают в него ампулы на 15 минут и добавляют при помешивании жидкий азот или сухой лед; доводят температуру до -32 °C (температура должна быть не выше -28 и не ниже -32 °C). Далее переносят ампулы в жидкий азот.

При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой +37 — +40 °C, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5–1 минуты.

После размораживания клетки отмывают либо в ростовой среде (животные), либо в поддерживающей среде. Растительные клетки также можно отмывать 3-10 % раствором сахарозы.

Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Окончательным критерием служит четкое возобновление роста на стандартных питательных средах, используемых для данной культуры.

Перевиваемые культуры животных клеток после размораживания имеют повышенную чувствительность к вирусам, которая проявляется в течение первых двух пассажей. Далее чувствительность возвращается к исходной.

Замедление роста

Замедления роста можно добиться следующими методами:

1. Хранение под слоем минерального масла (для бактериальных и грибных культур).

2. Изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда.

3. Изменение светового режима.

4. Охлаждение до температуры прекращения активного роста.

5. Применение гормональных и осмотических ингибиторов. Из гормональных ингибиторов наиболее часто используют хлорхолинхлорид (для растительных клеток), из осмотических — маннит в концентрации 3–6 %.

6. Замена СаСL2 на Са(NО3)2 в питательных средах.

Для картофеля в качестве способа, позволяющего сохранить генофонд, рекомендуется клубнеобразование в пробирках.

БЕСКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ

Мембраны хлоропластов

Американский ученый М. Кальвин, чьи исследования в области изучения механизма фотосинтеза были отмечены Нобелевской премией, в 1972 году выдвинул идею создания фотоэлемента, в котором в качестве источника электрического тока служили мембраны хлоропластов. Основной компонент таких мембран — хлорофилл, способный при освещении отдавать и принимать электроны. В качестве проводника, контактирующего с хлорофиллом, Кальвин использовал оксид цинка. Мембраны, содержащие хлорофилл, помещали в раствор ферментов, действующих как катализаторы ЭТЦ. На свету происходит фотолиз воды: Н2O —> Н2 + 1/2 O2. При освещении этой системы в ней также возникал электрический ток плотностью 0,1 мкА на см2. Такой фотоэлемент функционировал недолго, поскольку хлорофилл вскоре терял способность отдавать электроны. Для того чтобы продлить время действия фотоэлемента, был использован дополнительный источник электронов — гидрохинон. В такой системе хлорофилл отдавал не только свои электроны, но и электроны гидрохинона. Полученный таким образом фотоэлемент площадью 10 м2 может обладать мощностью 1 кВт.

Японский ученый Фудзио Такахаси для получения электроэнергии использовал хлоропласты из листьев салата. Транзисторный приемник, к которому была присоединена такая солнечная батарейка, успешно работал.

Если из системы убрать проводник и индуцировать образование водорода и кислорода, то система может служить также прототипом фотореактора, при помощи которого энергия Солнца запасается в ценном топливе — водороде.

Преимущества системы:

— наличие избытка субстрата — воды,

— нелимитируемый источник энергии — Солнце,

— продукт (водород) можно хранить, не загрязняя атмосферу,

— продукт имеет высокую теплотворную способность (29 ккал/г) по сравнению с углеводородами (3,5 ккал/г),

— процесс протекает при нормальной температуре без образования промежуточных токсических веществ,

— процесс циклический, так как при окислении продукта образуется субстрат — вода.

Мембраны хлоропластов можно иммобилизовать, закрепляя их в