Добавление предшественников не всегда однозначно влияет на рост, потребление питательных веществ и синтез метаболитов. Например, действие орнитина на клетки Datura innoxia скорее отрицательно, а изокаприновой кислоты на клетки Capsicum frutencens — скорее положительно, так как сырая масса увеличивается, но выход капсомицина остается прежним. В обоих случаях синтез метаболитов не ингибируется альгинатным гелем.

Полученные результаты свидетельствуют о сохранении жизнеспособности клеток многих видов растений при иммобилизации. Иммобилизованные клетки, полученные из рыхлых, быстро растущих суспензионных культур, замедляют рост и приобретают сходство с клетками каллусной культуры. Эти клетки более взаимосвязаны, чем в жидкой культуре, что ведет к возникновению определенного физического и химического градиентов.

Иммобилизованные клетки аккумулируют больше алкалоидов, чем в жидкой культуре, что ведет к возникновению определенных физических и химических градиентов. Это способствует переходу клеток в стационарную фазу, что приводит к ускорению образования алкалоидов и других веществ вторичного происхождения.

Общие рекомендации к культивированию клеток на основе полученных результатов.

1. Клетки должны выращиваться физически стационарно, в тесном контакте друг с другом, чтобы стимулировалось развитие физических и химических градиентов и обеспечивалась частичная дифференцировка культуры. Некоторые виды растений необходимо культивировать при освещении и индуцировать образование хлоропластов, чтобы обеспечить уровень метаболизма, близкий к происходящему в клетках интактного растения.

2. Состав питательной среды и уровень кислорода необходимо регулировать для замедления роста культуры. Рекомендуется использовать регуляторы роста для имитации процессов дифференциации, происходящих in vivo.

3. Клетки необходимо снабжать предшественниками, но в низких концентрациях. Предшественники должны быть максимально близки в цепочке превращений к исходному продукту.

4. Желательно использовать клетки, которые секретируют необходимые метаболиты в питательную среду или клетки, у которых такую секрецию можно индуцировать.

ПРОТОПЛАСТЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК КАК ОБЪЕКТ БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНСТРУИРОВАНИЯ

Применение изолированных протопластов

Протопласты являются уникальной моделью для изучения фундаментальных физиологических проблем у растений. Они незаменимы при изучении состава, структуры и функционирования плазмалеммы в норме и при воздействии на нее гормонами, ингибиторами, фитототоксинами, а также при взаимодействии самих протопластов в популяции. Кроме того, протопласты могут использоваться для определения состава и архитектоники первичной клеточной стенки и изучения механизма ее репарации после разрушения.

На схеме (рис. 15) представлены основные направления физиологических исследований с использованием культуры изолированных протопластов.

Рис. 15 (ниже). Изолированные протопласты — объект и модель в физиологических исследованиях

(по Р.Г. Бутенко, 1981)

Таким образом, изолированные протопласты имеют ряд областей применения, как теоретического, так и прикладного характера:

1. Изучение химии и структуры клеточной стенки (и при разрушении, и при синтезе «de novo»).

2. Изучение свойств плазмалеммы, трансмембранных перемещений.

3. «Мягкое» выделение органелл.

4. Наблюдение за закономерностями дифференцировки клеток при слиянии протопластов, отслеживание взаимодействия ядра и цитоплазмы в полученной гибридной клетке, изучение соматических гибридов.

5. Введение чужих органелл.

6. Введение чужеродных генов в растительную клетку (трансгенез).

Способы получения и культивирования протопластов

Получение протопластов

Протопласт — клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:

— невысокая производительность,

— можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом, трудоемкость и длительность,

Другой метод выделения протопластов — энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.

Преимущества энзиматического метода по сравнению с механическим:

— одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или клеток),

— клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу,

— клетки не повреждаются,

— метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.

Выделение протопластов проводят в три этапа:

— обработка ферментами,

— выделение протопластов из клеточных стенок,

— отделение интактных протопластов от клеточных осколков.

Стандартная методика протопластов (по Такебе) из тканей листа Nicotiana tabacum:

Зрелый, сформировавшийся лист отделяют от взрослого растения в возрасте 60–80 дней, окунают в 70 % этанол, а затем помещают на 15–20 минут в 10 % раствор гипохлорита кальция и многократно промывают дистиллированной водой. С помощью пинцета нижний эпидермис снимают, очищенные от эпидермиса листья разрезают скальпелем на небольшие кусочки площадью 4 кв. см. Для лучшего снятия эпидермиса листья должны немного подвянуть, можно также ограничить снабжение водой перед срезанием листьев.

Далее ткань обрабатывают последовательно или одновременно пектиназой, вызывающей мацерацию, и целлюлазой, разрушающей клеточные стенки. Оптимальная концентрация ферментов, как и время обработки, индивидуальны для разных тканей. Протопласты должны находиться в растворе ферментов минимальное количество времени, после чего следует тщательная промывка. Ферменты стерилизуют через бактериальные фильтры.

Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт "голый", один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (СаСl2, КСl) в концентрации 0,3–0,8 моль/литр. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.

Удобнее обрабатывать ткани ферментами в чашке Петри, которую держат под углом 15°. Смесь ферментов с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами: либо фильтрация с центрифугированием, либо флотация.

При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании оседают протопласты, осколки остаются в супернатанте. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования.

Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40–80 до 350 д. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего — в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны.

Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических