Шрифт:
Закладка:
Схема очистки сводится к следующему:
— освобождение от нерастворимых веществ;
— освобождение от сопутствующих растворимых веществ;
— фракционирование (как правило, хроматографическими методами).
Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген — вода. При этом в раствор переходят сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более 6–8 % влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без потери активности.
Стандартизация ферментного препарата — доводка активности фермента до стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются различные нейтральные наполнители — крахмал, лактоза и др.
Учитывая огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов.
БИОТЕХНОЛОГИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
Препараты, производимые для сельского хозяйства, делятся на 3 группы:
— энтомопатогенные препараты;
— бактериальные удобрения;
— антибиотики.
Отечественное биотехнологическое производство выпускает 3 группы энтомопатогенных препаратов:
1. Бактериальные препараты на основе Bacillus thuringiensis — энтобактерин-3, дендробациллин, инсектин, токсобактерин.
2. Грибной препарат боверин на основе гриба Beauveria bassiana.
3. Препараты на основе вирусов ядерного полиэдра (вирин-ЭНШ, вирин-ЭКС и ДР.).
Все микробные патогены выпускаются в виде смачивающих порошков, паст, реже — гранул, эмульсии спор и кристаллов. При непосредственном применении предполагается использование различных добавок в виде растворителей, прилипателей, способствующих повышению их эффективности. Технология получения бактериальных энтомопатогенных препаратов. Наибольшее распространение среди промышленно выпускаемых микробных патогенов получили бактериальные препараты. Их отличительными особенностями являются высокая вирулентность по отношению к насекомым-вредителям, безопасность для окружающей флоры и фауны, достаточно высокая скорость воздействия на вредителей и др. В настоящее время производятся препараты против более 160 видов насекомых.
Бактериальные энтомопатогенные препараты
Из всех энтомопатогенных бактерий наиболее исследованы грамположительные бактерии Вас. thuringiensis. Она не только разрушает насекомое, попадая внутрь, но и продуцирует ряд токсичных продуктов. Среди этих токсичных продуктов выделяют 4 компонента:
— α-экзотоксин, или фосфолипаза С, — продукт растущих клеток бактерий. Токсическое действие фермента связывают с индуцируемым им распадом незаменимых фосфолипидов в ткани насекомого, что приводит к гибели последнего.
— β-экзотоксин — накапливается в культуральной жидкости при росте клеток. Считают, что молекула β-токсина состоит из нуклеотида, связанного через рибозу и глюкозу с аллослизевой кислотой. Его действие, видимо, обусловлено ингибированием нуклеотидазы и ДНК-зависимой РНК-полимеразы, связанных с АТФ, что приводит к прекращению синтеза РНК. По сравнению с другими токсинами действует медленнее, в основном при переходе от одного цикла развития к другому. По наблюдениям, р-экзотоксин — мутаген, поражающий генетический аппарат особей.
— γ-экзотоксин — малоизученный компонент, неидентифицированный фермент (или группа ферментов).
— δ-эндотоксин — параспоральный кристаллический эндотоксин. Образуется в процессе споруляции бактерии в противоположной от формирующейся споры части бактерии. На завершающей стадии спорообразования токсин приобретает форму 8-гранного кристалла. Кристаллы состоят из белка, аминокислотный состав которого близок для различных штаммов. Доказано, что кристаллический белок в кишечнике восприимчивых насекомых распадается на молекулы протоксина. Протоксин под действием протеиназ распадается на токсические фрагменты. Различие в восприимчивости некоторых видов насекомых к действию кристалла, по-видимому, связано с присутствием специальных кишечных протеаз, осуществляющих гидролиз кристаллов in vivo. Такими протеазами обладают не все насекомые, отсюда и избирательность действия 5-токсина. Чтобы насекомое погибло, кристаллы должны попасть в его организм. После поглощения кристаллов гусеницы перестают питаться. Первичным местом действия 5-токсина является средний отдел кишечника.
В зависимости от реакции на кристаллы насекомые делятся на три группы:
— характерен общий паралич;
— паралич среднего отдела кишечника;
— реакция на препарат в целом: гибель в результате прорастания спор и последующего размножения бактерий.
Бактерии Вас. thuringiensis антагонистичны к 130 видам насекомых. Наибольший эффект достигается при применении препаратов этой группы против листогрызущих вредителей. Наиболее распространенные препараты на основе различных вариаций Вас. thuringiensis: энтобактерин, инсектин, алестин, экзотоксин, токсобактерин, дендробациллин, битоксибациллин.
Промышленное производство энтомопатогенных бактерий (ЭБ) заключается в глубоком культивировании. При этом ставится задача получения максимального титра клеток в культуральной жидкости и накопления токсина. Требования к промышленным штаммам ЭБ: принадлежность штамма к определенному серотипу, высокая вирулентность и продуктивность на промышленных средах, устойчивость к комплексу фагов и т. д. Технология производства включает все стадии, типичные для любого биотехнологического производства. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной (28–30 °C), продолжительность ферментации составляет 35–40 часов. Используют дрожже-полисахаридную среду, содержащую в процентах: кормовые дрожжи — 2–3; кукурузную муку — 1–1.5; кашалотовый жир — 1. Перед началом культивирования pH составляет около 6.3, к концу ферментации — повышается до 8.0–8.5, что может привести к разрушению кристаллов на более мелкие фрагменты и затруднить их выделение. Чтобы предотвратить это, культуральную жидкость перед переработкой подкисляют до 6.0–6.2. Культивирование заканчивают при степени споруляции 90–95 % и титре спор не менее 109 в 1 мл. После сепарации культуральной жидкости получают пасту влажностью 85 % с выходом около 100 кг в 1 кубометре культуральной жидкости и титром порядка 20*109 спор в 1 грамме. Фугат можно употребить для приготовления питательной среды, но не более 1–2 раз, так как в культуральной жидкости накапливаются вещества, ингибирующие развитие культуры. Фугат находит свое применение в качестве сырья при производстве кормовых дрожжей, что обеспечивает сокращение промышленных стоков и снижает расход воды. Пасту перемешивают в течение получаса для однородного распределения спор и кристаллов и отбирают пробы на проверку титра, влажности, вирулентности, наличия фага.
Конечный продукт — смачивающий порошок или стабилизированная паста. Первый получают путем высушивания увлажненной пасты на распылительной сушке. Готовый препарат фасуют по 20 кг в четырехслойные крафт-мешки с полиэтиленовым вкладышем. Вторую — внесением в пату КМЦ. При смешении молекулы КМЦ сорбируют белковые кристаллы и споры, заряжая их отрицательно, что способствует равномерному распределению активного начала по всему объёму и увеличению срока хранения. Готовый препарат — вязкая жидкость кремового или светло-серого цвета, без запаха, не замерзающую при хранении. Препарат предназначен для борьбы с садово-огородными вредителями, эффективен против 60 видов насекомых. Применяют путем опрыскивания растений водной эмульсией в период активного роста вредителя. Основная масса вредителей погибает в течение 2-10 дней. На 1 га расходуют: для овощных культур 1–3 кг, садовых — 3–5 кг.
Грибные энтомопатогенные препараты
Энтомопатогенные препараты на основе микроскопических грибов вызывают
