Шрифт:
Закладка:
Напоминание: не забудьте ознакомиться с методикой стерильной работы и методикой стерилизации растительного экспланта.
МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ
Микроразмножение томатов или табака черенкованием побегов
Материалы и оборудование
Пробирочные растения томатов или табака, пробирки с питательной средой МС, стерильные скальпели, пинцеты, чашки Петри.
Размножать некоторые растения можно путем черенкования в пробирочной культуре. Для этого растения разрезают на части. Черенки пересаживают в пробирки с питательной средой МС. Размножение черенкованием основано на подавлении апикального доминирования и активации пазушных меристем путем удаления верхушечного побега. При помещении побега на питательную среду из пазушных меристем появляется побег. Черенкование проводят с интервалом 14–21 день. Из 1 растения получают 5–8 черенков, за 2–3 месяца это составит 3–5 тысяч растений (при условии, что вы все делаете правильно и в условиях абсолютной стерильности).
Ход работы
Пробирочное растение вынуть из пробирки, поместить в стерильную чашку Петри, разрезать на части (отрезок стебля с листом и пазушной почкой), часть стебля над листом должна быть при этом в 2–3 раза меньше, чем часть ниже лис та. Необходимо соблюдать строгую стерильность. Черенки перенести на свежую питательную среде в пробирки. Для предотвращения попадания микроорганизмов в пробирки обжечь горлышко и ватную пробку в пламени спиртовки. Пробирку поставить в световую камеру. Наблюдать за развитием побега.
Клональное микроразмножение роз
Материалы и оборудование
Однолетние побеги роз, скальпель, кисточка, пинцет, стаканчик с этанолом, пробирки со стерильной водой, 4 % раствор хлорамина, чашка Петри, кафельная плитка, спиртовка, спички, пробирки с модифицированной питательной средой МС, ее компоненты:
— макроэлементы по прописи МС
— микроэлементы по прописи МС
— хелат железа витамины по прописи МС
— источник углерода: глюкоза — 40 г/л
— агар-агар 7 г/л
— гормоны: гиббереллин — 0.1 мг/л, 6-ЕАП — 2 мг/л
— pH готовой среды 5.6–5.8).
Ход работы
В качестве экспланта используют боковые почки из средней части 1-летнего побега. Побеги промывают водопроводной водой с мылом, ополаскивают дистиллированной водой, вырезают почку. Стерилизуют сначала 70 % этанолом в течение 1 минуты, а затем в растворе хлорамина 10 минут. Трижды промывают стерильной дистиллированной водой (в каждой порции по 10 минут). Срезы обновляют, снимают почечные чешуи и переносят почки на агаризованную питательную среду в пробирки. В некоторых случаях экспланты переносят на свежую питательную среду, так как в среду выделяются полифенолы. Культивируют при температуре 18–25 °C, освещенности 500-1000 люкс, 16-часовом фотопериоде. Пассируется через 3–4 не дели. Для укоренения побеги переносят на среду Гамборга (В5) с добавлением 1 мг/л ИУК и увеличивают интенсивность освещения до 2000 люкс.
Перенос посадочного материала в почву
Материалы и оборудование
Пробирки с растениями, горшки с почвой; почву желательно прогреть или проавтоклавировать до посадки растений.
Ход работы
Сделать пробиркой углубление в увлажненной почве в горшке. Пробирочное растение вынуть из пробирки, поместить в горшки с почвой, не отмывая агаровой среды. Уплотнить почву вокруг растения. Первые 3–5 дней желательно прикрывать растения стеклянным колпаком. Через 10 дней растения пересаживают на постоянное место в теплице.
ПОДДЕРЖАНИЕ И СОХРАНЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
Поддержание и сохранение культуры картофеля
Материалы и оборудование
Пробирки с растениями картофеля, стерильный пинцет, скальпель, кисточка, стаканчик с этанолом, чашка Петри, кафельная плитка, спиртовка, спички, пробирки с питательной средой МС.
Для замедления роста растений из черенков ТУР (ретардант, применяемый в сельском хозяйстве против полегания стеблей растений — хлорхолинхлорид, ССС) в концентрации 0.4–0.5 мл/л добавляют в среду МС, при этом промежуток между двумя последующими черенкованиями увеличивается с 1 до 4 месяцев, а высота со сближенными междоузлиями не превышает 3–4 см. Растения приобретают темно-зеленую окраску.
Одним из способов сохранения и поддержания коллекции in vitro является клубнеобразование в пробирках. На процесс образования клубней in vitro оказывает влияние фотопериод, температура, ростовые вещества, содержание сахарозы в питательной среде.
Ход работы
Черенки переносят на модицифированную питательную среду МС для образования клубней картофеля, ее компоненты:
Макроэлементы по прописи МС
Микроэлементы по прописи МС
Источники железа
Витамины по прописи МС + аденин — 0.25 мг/л
Источник углерода: сахароза — 70 г/л
Агар-агар — 7 г/л
Гормоны: ИУК — 1 мг/л
pH готовой среды — 5.6–5.8.
Культивирование черенков проводится под люминесцентными лампами при 10 часовом фотопериоде, освещенности 3.5–4 тыс. люкс, влажности 70 %. После трехнедельного выдерживания на 10-часовом фотопериоде растения переносят на 2 суток в темноту, а затем на 16 часовой период и оставляют в этих условиях до завершения клубнеобразования. После отмирания растений и достижения микроклубнями размера 0.7–1.4 см их извлекают из пробирок (в стерильных условиях) и хранят в пробирках, закрытых ватными пробками, в холодильнике, при температуре +2 — +4 °C.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК
Культивирование фибробластов человека
Культуральная посуда и оборудование
Пипетки мерные от 1 до 10 мл, пипетки Пастера, пенициллиновые флаконы, пробирки Лейтона, мерные флаконы от среды разных объемов, пробки резиновые № 10, 12.5, 14.5, 24; стекла покровные для микроскопии, предварительно нарезанные для помещения их в пенициллиновые флаконы, пинцеты глазные анатомические и хирургические, зажим Кохера, бритва безопасная, препаровальная игла из нержавеющей стали, резиновая груша для работы с пипетками (с надетой резиновой трубкой), инвертированный микроскоп, ламинар-окс, термостат.
Питательная среда
Фибробласты успешно культивируют на разных средах, но рекомендуется использовать следующий состав питательной среды — среда Игла — 90–85 %, сыворотка крупного рогатого скота — 5-10 %, пуповинная сыворотка человека (фетальная сыворотка) — 5 %, глютамин — 150 мг на 500 мл готовой среды. Готовую среду и её компоненты рекомендуется хранить при 4 °C. При культивировании эксплантов рекомендуется использовать антибиотики (40–60 мкг канамицина на 1 литр среды).
Ход работы
1. Взятие биопсии. Фибробласты можно получать из многих тканей и органов. Проще всего — фибробласты дермального слоя кожи. Наиболее удобно брать биопсию со внутренней стороны предплечья левой руки (нижняя треть). Кожу дезинфицируют 70 % этиловым спиртом. Не рекомендуется употреблять другие дезинфицирующие растворы, так как в случае проникновения в биопат они могут оказать токсическое действие. После дезинфекции кожу захватывают глазным хирургическим пинцетом, оттягивают и отрезают кусочек кожи непосредственно под браншами пинцета. Не следует стремиться взять глубокие слои кожи. При правильно взятой биопсии, захватывающей эпидермис и сосочковый слой кожи, кровотечение минимально. Отсечение лучше
